Охарактеризиране и анализ на ефекта от въздействието на UV-А и UV-В радиация, обща β- и γ-активност и космически лъчи върху основни физиологични, цитогенетични и хематологични и показатели при експерименталните животни в условията на две надморски височини. Получаване на достоверни данни, които да потвърдят заложената хипотеза за въздействието.
Участници в изпълнението на дейностите по работния пакет:
проф. д-р Румяна Мечева
доц. д-р Mаргарита Топашка-Анчева (пенсионер)
доц. д-р М. Недялкова
Биол. спец. Илиана Алексиева
Проведен е 40-дневен експеримент при контролирани условия за установяване на комбинираното въздействие на естествения радиоактивен фон и UV радиацията върху основни физиологични показатели на организма на лабораторни мишки при високопланински условия на връх Мусала. Проследено е телесно тегло и пробовземания на 15-ти, 30-ти и 40-ти ден от експеримента.
На всяка установка бе монтиран специален UV-сензор (Tyutyundzhiev et al. 2017) – UV сензор
Проведен е анализ за ранни генетични промени в кръвната картина на експерименталните животни с отчитането на базофилни пунктации и телца на Howell-Jolly.
Извършен е цитогенетичен анализ за отчитане на генотоксичното въздействие от комбинираното въздействие на UV радиацията, естествения радиоактивен фон и космическите лъчи върху експерименталните животни.
Охарактеризирано е и поулационното и физиологичното състояние на мониторни видове дребни гризачи (фиг.3) - жълтогърла горска мишка (А), ръждива горска полевка(Б) и снежна полевка от двете надморски височини на Рила планина, както и въздействията върху техния организъм от естествения радиационен фон и общата β- активност.
Проведено бе пилотно и уникално изследване на хронично изложени в продължение на 40 дни на естествена UV ирадиация и космическите лъчи лабораторни бели мишки при две надморски височини в Рила планина и района на язовир Бели Искър (местността „Скакавците“) (1500 м н.в.) и връх Мусала (2925 м н.в.). Подборът на надморските височини е съобразено с факта, че мощността на UV-радиацията се увеличава с 10 % на всеки 1000 метра или по-точно с 1 % на всеки 100 метра. Дълбочината на проникване на светлинната енергия зависи от дължината на вълната (от 0.1 до 0.6 мм) и оптичните свойства на средата. Биологически активната UV ирадиация въздейства по много сложен начин с клетките на бозайниците. За целта беше подбран период с най-голяма продължителност на деня и слънчево греене – (16 юни – 26 юли 2017). За да може в максимална степен да се проявят и отчетат ранните генетични промени от горепосочените въздействия и да се елиминират адаптациите на организма към надморската височина, най-подходящи моделни видове са лабораторни бели мишки, „линия-ICR“.
Биологично действие оказва само количеството акумулирана енергия (фиг.4, 5, 6 и 7). За целта бяха конструирани специализирани експериментални установки, които да пропускат отделните видове лъчения ( фиг.6 А и Б).
Хематологичен анализ
Наблюдаван е ранен мутагенен ефект в кръвните клетки на експерименталните животни като базофилни пунктации и телца Howell-Jolly в еритроцитите (фиг.8).
Базофилни пунктации
Анализът на получените резултати показва постепенно увеличаване на телцата на Howell-Jolly (микронуклеуси) от 15-ия до 40-ия ден на експеримента.
Хромозомни мутации (хромозомни аберации)
Вътрехромозомни преустройства
Резултатите от генотоксичния ефект от комбинираното въздействие на UV радиацията, естествения радиоактивен фон и космическите лъчи върху експерименталните животни показват различни видове вътрехромозомни преустройства като: хромозомни аберации - прекъсвания, фрагменти, центрометрични и теломерни прикрепяния (фиг.9, 10 и 11). Най-чести са разкъсвания, който водят до образуване на ацентрични фрагменти, хроматидни и изохроматидни разкъсвания.
Анализът на стойностите показва, че процентът на метафазите с аберации в пробите от Мусала варира от 8.75 ± 0.75% на 15-ия ден от началото на въздействието, леко се покачва на 30-тия ден - 9.5 ± 0.82% и достига максимална стойност 10.75 ± 0.92% на 40-ия ден от началото на експеримента.
Най нисък процент клетки с увредени хромозоми че отчитат в пробите от 15-ия ден (5.50 ± 0.63), а най-високи на 40-тия ден (7.25. ± 0.99). Тенденцията за леко повишаване на увреждащия ефект на продължителността на въздействие се запазва, но и при двата варианта на изследване разликата не е статистически достоверна.
По отношение на типовете аберации (хроматидни – разкъсвания и фрагменти) и хромозомни (центромерно/центромерни сливания) не се наблюдава съществена разлика, което е обяснимо, тъй като факторът, който предизвиква промените в структурата на хромозомите е един и същи за двете експериментални постановки.
Сравнени с данните за позитивната контрола, получените данни за кластогенния ефект на УВ радиацията върху хромозомния апарат на експерименталните животни показват че този фактор има умерен кластогенен ефект, който не се променя значимо с удължаване на времето на въздействие. В същото време, той е значително по-висок в сравнение със стойностите на този показател, отчетени в нетретираните контролни животни.
Мониторни видове мишевидни гризачи
За да се охарактеризира поулационното и физиологичното състояние на мониторни видове дребни гризачи от двете надморски височини на Рила планина, както и въздействията върху техния организъм от естествения радиационен фон и общата β-активност.
Резултатите от пресмятането на относителната численост на дребните гризачи от двата изследвани района беше относително стабилна, като нейните стойности при отделните видове е тясно свързана с надморската височина и тяхната биотопичната привързаност. Относително по-ниската численост на женските индивиди най-вероятно е тясно свързана с размножителния период, когато голяма част от тях са бременни или отглеждат потомство и са слабо активни. При жълтогърлата горска мишка от района на Бели Искър 28% от женските индивиди бяха бременни, като за Мусала относителният им дял бе приблизително същия – 25%. Младите индивиди съставяха съответно 12.5% и 50% от състава на популацията. Най-ниска численост бе констатирана за подземната полевка от района на Мусала, където е установен подходящ за обитанието на вида биотоп.
Хематологични показатели
Адаптационните механизми на животните към по-големи надморски височини по отношение на хематопоезата се изразяват в нарастване на средния брой на еритроцитите и количеството на хемоглобина и при двата уловени вида от връх Мусала в сравнение с тези от Бели Искър.
Обща β-активност на мониторни видове мишевидни гризачи, тревна растителност от двете изследвани надморски височини.
При мониторните видове мишевидни гризачи Apodemus flavicollis (жълтогърла горска мишка) от в. Мусала (2925 м н.в.) Chionomys nivalis (снежна полевка) и Apodemus flavicollis (жълтогърла горска мишка) и Myodes (Clethrionomys) glareolus (ръждива горска полевка) от района на Бели Искър (1500 м н.в.) бе проведен радиометричен анализ за обща β-активност.
Сравняването на получени резултати показва известни разлики в нейната биоакумулация от двата изследвани района.
При горските мишки Ap. flavicollis от връх Мусала стойностите варират от 144 до 309 Bq.kg-1 и от 168 до 491 Bq.kg-1 за района на Бели Искър.
При полевките стойностите са значително по-високи както при тези от вр. Мусала, така и при тези от Бели Искър и варират съответно от 203 to 623 Bq.kg-1 при Ch. nivalis (Мусала), докато при отделни екземпляри от Cl. glareolus (Бели Искър) достигат до 1081 Bq.kg-1.
Получените резултати могат да се считат за референтни . Те са 10 пъти по-ниски в сравнение с тези получени преди 20 години за същите видове. Според Thorn и Vennard (1976) общата β-активност при бозайници не трябва да надвишава 4800 Bq.kg-1. В случай на по-високи стойности е необходим анализ на всеки отделен радионуклид. В заключение - равнището на общата β-активност получена при изследваните мониторни видове мишевидни гризачи от Рила е относително ниска.
Общата β-активност в тези проби се дължи в основна степен на съдържанието на естествения радионуклид 40K. Резултатите са съпоставими с получените от други региони. Ниски стойности на обща β-активност предполага и много ниски активности на β-излъчващи нуклиди, включително и 40K.
При тревните растителни видове, основен компонент в хранителния спектър на мониторните видове дребни гризачи са алпийска ливадина (Poa alpina) (фиг. 12 А) и гълъбовосиня гъжва (Sesleria coerulans) (фиг. 12 Б). Резултатите за растителни проби показват стойности съответно 413 Bq.kg-1 до 394 Bq.kg-1.
С най-ниска обща β-активност са планинско-ливадните почви поради ниското им съдържание на 40K, където той е главният компонент.
Висшите растения съдържат също голямо количество 40K, което обуславя от 60 до 85% тяхната β-активност. Рaдиoaктивнитe вeщeствa сe включвaт в хранителната верига. Житните растения са основен хрaнителен компонент на изследваните мониторни видове мишевидни гризачи и имат съществен дял при акумулирането на радиоактивни вещества.
Провеждане на 40-дневен експеримент в контролирани лабораторни условия
за установяване на биологически активно въздействие UV лъчениеСпектърът на UV светлина от изкуствените източници се различава от спектъра на слънчевото UV лъчение. Атмосферата пропуска най-много UV лъчи с по-голяма дължина на вълната, докато спектърът на UV лампи съдържа лъчение и от трите зони.
За целта през м. май 2018 г. бе проведен 40-дневен лабораторен експеримент с лабораторни бели мишки „линия-ICR“ при контролирана мощност на UV лъчението, в стойности близки до естествените, измерени на връх Мусала (фиг.13). Бях взети проби от опитните животни за основни морфологични, хематологични и цитогенетични показатели на 15-тия, 30-ти и 40-ти ден от изследването.
През втория етапна проекта отново са проведени теренни изследвания върху мониторни видове диви дребни гризачи от районите на двете избрани надморски височини, като целта бе установяване на нивата на общата бета активност в тялото на животните и оценка на физиологичното състояние на организма.
За да се охарактеризира поулационното и физиологичното състояние на мониторни видове дребни гризачи от двете надморски височини на Рила планина, както и въздействията върху техния организъм от естествения радиационен фон и общата бета активност бяха провеждани изследвания на територията при две надморски височини – в близост до яз. Бели Искър (местността „Скакавците“ 1500 м н. в.), и в. Мусала (2925 м н. в.) Бяха уловени следните видове дребни гризачи: от местността „Скакавците“ – жълтогърла горска мишка (Apodemus flavicollis) (А) -18 бр. и ръждива горска полевка (Clethrionomys glareolus) (Б) – 12 бр.; от района на връх Мусала - жълтогърла горска мишка (Apodemus flavicollis) -6 бр., снежнa полевка (Chionomys nivalis) (В) и подземна полевка (Pytimys subterraneus) – 2бр. Уловите бяха извършени с убиващи и живоловни капани, с примамка от овесени ядки, по стандартна методика. Всички уловени животни бяха определени по вид и пол и бяха снети основни морфометрични показатали (тегло, дължина на тяло, опашка, ухо и стъпало).
Проведени са радиоекологични проучвания за наблюдение на дребни гризачи от две различни височини в Рила планина (югозападна България). Жълтогърла горска мишка (Apodemus flavicollis) и ръждива горска полевка полевка (Clethrionomys glareolus) от района на Бели Искър (1500 м н.в.) и жълтогърла горска мишка (Apodemus flavicollis) и снежна полевка (Chionomys nivalis) от връх Мусала (2925 м н.в.) са използвани за оценка на състоянието на околната среда.
Измерването на бета активността в тялото на животните е извършена от участници в РП1.
От всички животни бяха събрани кръвни проби за хематологичен анализ и бяха изготвени кръвни натривки за левкограма.
През вторият етап на проекта бе проведен лабораторен експеримент за отчитане ефекта на UV-A+UV-B радиацията, който в максимална степен повтаря условията във високата планина. За да се елиминират ефектите на околната среда за животните, изследването беше проведено при стандартни лабораторни условия - температура, влажност и светлинен режим и контролирана мощност на UV лъчението. Бяха взети проби от опитните животни за основни морфологични, хематологични и цитогенетични показатели на 15-тия, 30-ти и 40-ти ден от изследването. Лабораторната установка е разработена от участници в РП1.
Видовият състав и структурата на популациите на уловените дребни бозайници от двата изследвани района са представени в долната таблица.
Резултатите от пресмятането на относителната численост на дребните гризачи от двата изследвани района беше относително стабилна, като нейните стойности при отделните видове е тясно свързана както с надморската височина, така и тяхната биотопичната привързаност. Относително по-ниската численост на женските индивиди най-вероятно е тясно свързана с размножителния период, когато голяма част от тях са бременни или отглеждат потомство и са слабо активни. При жълтогърлата горска мишка от района на Бели Искър 28% от женските индивиди бяха бременни, като за Мусала относителният им дял бе приблизително същия – 25%. Младите индивиди съставяха съответно 12.5% и 50% от състава на популацията. Най-ниска численост бе констатирана за подземната полевка от района на Мусала, където е установено подходящо местообитание за вида.
Сравненията на данните, получени от измерванията на общата β-активност, показват някои разлики в биоакумулацията между наблюдаваните видове от двата региона. Стойностите в изследваните гризачи показват големи вариации: от 144 до 1081 Bq.kg-1 без зависимост от региона и вида. В Ap. flavicollis от Мусала те варират от 144 до 309 Bq.kg-1 и от 168 до 491 Bq.kg-1 за по-ниската надморска височина. За M. Glareolus тези стойности достигат 1081 Bq.kg-1. Измервания от телата на Ch. nivalis от връх Мусала варират от 203 до 623 Bq.kg-1. Получените резултати могат да се считат в нормата.
Настоящото изследване показва спад на измерената обща целотелесна β-активност в дребни гризачи от алпийските екосистеми в Рила планина, България. Този спад е по-изразен при видовете от Apodemus и Ch. nivalis и по-слабо изразен при M. glareolus, явление, дължимо на по-голямото значение на 137Cs като компонент от като цяло намалялото замърсяване с антропогенни β-лъчители. Счита се, че общата β-активност при бозайниците трябва да бъде по-малка от 4800 Bq.kg-1. Ако е по-висока, значи, че са необходими измервания на концентрациите на всеки радионуклид. Както показват резултатите, нивата на общата β-активност в изследваните видове дребни бозайници от Рила са относително ниски в сравнение с установените референтни стойности. Нивата на съдържание на β-лъчители при дребните бозайници може да се счита за нормално за проучените региони. Получените данни могат да се считат за референтни и да се използват за по-нататъшни мониторингови разследвания и за проследяване на натрупването β-лъчители на различни нива на трофичните вериги в екосистемите. Настоящото изследване показва спад на измерената обща целотелесна β-активност в дребни гризачи от алпийските екосистеми в Рила планина, България. Този спад е по-изразен при видовете от Apodemus и Ch. nivalis и по-слабо изразен при M. glareolus, явление, дължимо на по-голямото значение на 137Cs като компонент от като цяло намалялото замърсяване с антропогенни β-лъчители.
Основните хематологични показатели при мониторните видове мишевидни гризачи са представени в долната таблица.
Адаптационните механизми на животните към по-големи надморски височини по отношение на хематопоезата се изразяват в нарастване на средния брой на еритроцитите и количеството на хемоглобина и при двата уловени вида от връх Мусала в сравнение с тези от Бели Искър.
При проведеният лабораторен експеримент за отчитане ефекта на UVA+UVB радиацията бяха получени следните резултати:
Интензитетът на комбинираната UV-A и UV-B радиация беше същият като този, измерен на по-голяма надморска височина. Акумулираната доза се изчислява въз основа на 2-минутни UV измервания. Дневните дози бяха изчислени за целия период на експериментите. Получените резултати са представени в долната таблица.
Дълбочината на проникване на светлинна енергия зависи от дължината на вълната (0,1 до 0,6 mm) и оптичните свойства на околната среда. Биологично активното UV лъчение взаимодейства по много сложен начин с клетките на бозайници. Наблюдава се различна степен на промени в някои хематологични показатели като базофили, микроядра в еритроцити и еозинофили при изследваните животни и в трите експеримента. Причината тези три параметъра да бъдат предпочитани при отчитане на въздействиятае фактът, че тяхната промяна е един от първите признаци на алергични реакции, възпалителни процеси и наличие на тумори в организма. Резултатите са представени в долната таблица.
Данните показват статистически значимо увеличение на стойностите на Ео при опитни животни от Мусала в сравнение с тези от Бели Искър и контролната група. Стойностите им варират от 0,05% на 30-ия ден на Бели Искър до 1,3% на връх Мусала за 40-ия ден. На 30 -ия ден на двете височини са установени значителни разлики в сравнение с 15 -ия и 40 -ия ден. Важно е да се отбележи, че такива не са открити при животните при UV облъчване в лабораторни условия. Може да се предположи, че увеличеното количеството еозинофили в естествени условия вероятно се дължи на сложните екологични натоварвания, които не са характерни за лабораторните условия. Подобна тенденция се наблюдава и при разглеждане на базофилните гранулации и микроядрата в еритроцитите. При анализиране на данните за микроядра, открити в еритроцитите, става ясно, че пик се отчита около 30 ден на лабораторния експеримент. Имайки пред вид, че биологичната продължителност на живота на еритроцитите при мишките е около 40 дни, това може да се обясни с адаптивен отговор на хемопоетичната система на мишките, започващ в първите дни на облъчване. Базофилните гранулации в белите кръвни клетки следват подобна тенденция, което показва, че хемопоезата при мишките е засегната още в първите дни на ултравиолетовото облъчване.
Резултатите от микроядрения тест показват ясно изразена хромозомна нестабилност. Наличието на микроядра в еритроцитите е доказателство за структурни и/или числени хромозомни аберации, възникващи по време на митозата. Те са важен индикатор за откриване на генетични увреждания, предизвикани от различни видове радиация.
Като се вземе предвид кластогенният ефект от комбинирания ефект на ултравиолетовата радиация и естествената фонова радиация върху клетките на костния мозък, особено в експериментите в естествени условия, най-представителният показател е сумата от хроматичните счупвания и фрагменти.
Това изследване е новост в подхода си за проучване на ефектите от излагането на UV облъчване, което достига до дермо-епидермалната тъкан и прониква по-дълбоко в дермата и хиподермата. Поради тази причина се предполага, че кръвоносните съдове и кръвни клетки също могат да бъдат засегнати от излагане на ултравиолетови лъчи. Резултатите показват значително дозозависимо увеличение на микронуклеусите от 15-ия до 40-ия ден от експеримента. Понастоящем подходите, използвани за оценка на последиците от ултравиолетовото облъчване и гама фона, включват също оценка на генотоксични увреждания и други вредни за клетките ефекти върху организмите. Изследването отваря възможността за по -подробно проучване на отрицателното комбинирано действие на UV върху здравето и живота на организмите.